Escriu per cercar…

Primer (PCR)

bio/primer

Introducció

La idea de la reacció en cadena de la polimerasa, PCR (de l’anglès Polymerase Chain Reaction) la va desenvolupar Kary Mullis als anys 80. Amb aquesta tècnica va revolucionar la biologia molecular i per això va obtenir el premi Nobel.

La PCR és una tècnica in vitro que s’utilitza per amplificar enzimàticament una regió específica d’àcid desoxiribonucleic (ADN). La regió d’ADN d’interès queda delimitada per dos encebadors (“primers”), que són fragments curts d’ADN. La reacció pot començar a partir d’una sola cadena d’ADN, que s’amplifica fins a obtenir milions de còpies de l’original en poques hores.

Per millorar l’especificitat de la reacció has de seleccionar els encebadors amb cura i, així, disminuir el risc que es formin dímers i productes inespecífics que alterarien el resultat.

PCR

La PCR utilitza altes temperatures repetidament per desnaturalitzar el motlle d’ADN, és a dir, per separar-ne les cadenes.

L’ADN polimerasa que normalment s’utilitza a la PCR s’anomena Taq polimerasa, pel bacteri tolerant a la calor del qual es va aïllar (Thermus aquaticus).

T. aquaticus viu en aigües termals i fonts hidrotermals. La seva ADN polimerasa és molt termoestable i la màxima activitat la té a prop dels 70 ºC (una temperatura a la qual l’ADN polimerasa humana o d’E. coli no funcionaria). Gràcies a aquesta estabilitat tèrmica, la Taq polimerasa és ideal per a la PCR.

Primer

Igual que les altres ADN polimerases, la Taq polimerasa només pot fer ADN si hi ha un encebador (“primer”), una seqüència curta de nucleòtids que proporciona un punt de partida per a la síntesi d’ADN. En una reacció de PCR, la regió d’ADN que es copiarà, o amplificarà, la determinen els encebadors que triïs.

Els encebadors per a PCR són trossos curts d’ADN de cadena senzilla, generalment d’uns 20 nucleòtids de longitud. A cada reacció de PCR s’utilitzen dos encebadors dissenyats per flanquejar la regió diana (la regió que s’ha de copiar). És a dir, se’ls hi afegeixen seqüències que faran que s’uneixin a cadenes oposades del motlle d’ADN només als extrems de la regió que es vol copiar. Els encebadors s’uneixen al motlle per complementarietat de bases.

Quan els encebadors s’uneixen al motlle, la polimerasa els allarga i la regió que hi ha entre ells es copia.

Tots dos encebadors apunten “cap endins” quan s’uneixen, és a dir, en direcció 5’ → 3’ cap a la regió que s’ha de copiar. Igual que les altres ADN polimerases, la Taq polimerasa només pot sintetitzar ADN en direcció 5’ → 3’. En allargar-se els encebadors, la regió que hi ha entre ells es copia.

Passos

Els ingredients clau d’una reacció de PCR són la Taq polimerasa, els encebadors, l’ADN motlle i els nucleòtids (els blocs bàsics de l’ADN). Els ingredients es posen en un tub, juntament amb els cofactors que necessiti l’enzim, i se sotmeten a cicles repetits d’escalfament i refredament que permeten la síntesi de l’ADN.

Els passos bàsics són:

  1. Desnaturalització (96 ºC): la reacció s’escalfa força per separar, o desnaturalitzar, les cadenes d’ADN. Això proporciona els motlles de cadena senzilla per al pas següent.

  2. Hibridació (55 - 65 ºC): la reacció es refreda perquè els encebadors puguin unir-se a les seves seqüències complementàries del motlle d’ADN de cadena senzilla.

  3. Extensió (72 ºC): la temperatura de la reacció puja perquè la Taq polimerasa allargui els encebadors i sintetitzi així noves cadenes d’ADN.

Aquest cicle es repeteix 25 - 35 vegades en una reacció de PCR típica, que generalment dura ‍2 - 4 hores, segons la longitud de la regió d’ADN que es copia. Si la reacció és eficient (funciona bé), pot produir milers de milions de còpies a partir d’una o unes poques còpies de la regió diana.

Això és així perquè a cada cicle no només es fa servir l’ADN original com a motlle. De fet, l’ADN nou que es produeix en una ronda pot servir de motlle a la ronda següent de síntesi d’ADN. Hi ha moltes còpies dels encebadors i moltes molècules de Taq polimerasa surant dins la reacció, de manera que el nombre de molècules d’ADN gairebé es pot duplicar a cada cicle. La imatge següent mostra aquest patró de creixement exponencial.

Disseny d’encebadors

La propietat principal dels encebadors és que han de correspondre a seqüències de la molècula motlle (han de ser complementaris a la cadena motlle). Ara bé, no cal que els encebadors es corresponguin completament amb la cadena motlle; l’única cosa essencial és que l’extrem 3’ de l’encebador es correspongui completament amb la cadena d’ADN motlle perquè l’allargament pugui continuar.

Generalment s’utilitza una guanina o una citosina a l’extrem 3’, i l’extrem 5’ de l’encebador sol tenir trams de diversos nucleòtids. A més, els dos extrems 3’ dels encebadors hibridats han d’apuntar l’un cap a l’altre.

La mida de l’encebador també és molt important. Els encebadors curts s’utilitzen sobretot per amplificar un fragment d’ADN petit i simple. En canvi, per amplificar una mostra d’ADN genòmic eucariota s’utilitza un encebador llarg. Tot i així, un encebador no ha de ser ni massa llarg (encebadors > 30 unitats) ni massa curt. Els encebadors curts donen un producte d’amplificació d’ADN inexacte i poc específic, i els llargs donen una taxa d’hibridació més lenta. De mitjana, el fragment d’ADN que s’ha d’amplificar hauria de tenir una mida d’entre 1 i 10 kB.

L’estructura de l’encebador ha de ser relativament simple i no ha de contenir cap estructura secundària interna, per evitar el plegament intern. També cal evitar la hibridació encebador-encebador, que crea dímers d’encebador i interromp el procés d’amplificació. Si, en dissenyar-lo, no estàs segur de quin nucleòtid posar en una posició determinada de l’encebador, pots incloure més d’un nucleòtid en aquesta posició: és el que s’anomena un lloc mixt. També pots utilitzar un insert molecular basat en nucleòtids (inosina) en lloc d’un nucleòtid normal, per aconseguir capacitats d’aparellament més àmplies.

Tenint en compte la informació anterior, els encebadors generalment haurien de tenir les propietats següents:

  • Longitud de 18-24 bases

  • 40-60% de contingut de G/C

  • Començar i acabar amb 1-2 parells G/C

  • Temperatura de fusió (Tm) de 50-60 °C

  • Els parells d’encebadors han de tenir una Tm amb una diferència màxima de 5 °C entre ells.

  • Els parells d’encebadors no han de tenir regions complementàries.

Nota: si vols incloure un lloc de restricció a l’extrem 5’ del teu encebador, tingues en compte que cal afegir una “abraçadora” de 3 a 6 parells de bases aigües amunt perquè l’enzim talli eficientment (per exemple, GCGGCG-lloc de restricció-la teva seqüència).

Característiques dels encebadors

Longitud de l’encebador

Cada encebador sentit i antisentit ha de tenir una longitud d’entre 18 i 24 bases, ja que la quantitat de bases influeix en l’especificitat de la seqüència que es vol amplificar, sempre que la temperatura d’alineament sigui l’òptima. La longitud de l’encebador influeix en l’eficiència de l’alineament: com més llarg és l’encebador, menys eficaç és l’alineament. Com que a cada cicle s’uneix menys encebador a la seqüència d’ADN motlle, la conseqüència és que la quantitat de producte amplificat disminueix de manera significativa. Tot i això, els encebadors no han de ser massa curts, perquè es poden arribar a unir de manera inespecífica. La conseqüència són amplificats de productes no desitjats i una disminució del producte d’interès.

Especificitat

Els encebadors han de ser específics per delimitar la regió que es vol amplificar. L’especificitat de l’encebador depèn, almenys en part, de la seva longitud. Els encebadors s’han de triar de manera que tinguin una seqüència única dins l’ADN que es vol amplificar. Com que l’ADN-polimerasa es pot activar a temperatures diferents, l’extensió de l’encebador es produeix a una temperatura inferior a la d’alineament. Si la temperatura és massa baixa, es pot donar un alineament inespecífic. Els millors resultats s’obtenen amb una temperatura de fusió d’entre 55 i 72 ºC, que correspon a una longitud d’encebador d’entre 18 i 24 bases.

Temperatura de fusió (Tf)

La Tf és la temperatura a la qual la meitat de les cadenes d’ADN es troben com a banda simple i l’altra meitat com a banda doble. És desitjable que els encebadors tinguin Tf similars o molt properes, amb 5 ºC de diferència com a màxim. Si els encebadors no tenen Tf semblants, l’amplificació és menys eficaç i fins i tot pot no arribar a produir-se. L’encebador amb la Tf més alta funciona malament a temperatures més baixes, i el que té la Tf més baixa no s’uneix a temperatures més elevades. Per evitar aquests problemes durant la reacció, els encebadors s’analitzen amb eines bioinformàtiques que n’indiquen la Tf. Una altra manera de conèixer la Tf és calcular-la amb la fórmula Tf = 4(G+C) + 2 (A+T); aquesta fórmula dóna una bona aproximació del valor de Tf de cada encebador i és vàlida per als encebadors d’entre 18 i 24 bases.

Temperatura d’alineament

Els encebadors han de tenir una temperatura d’alineament de com a mínim 50 ºC. La relació entre la temperatura d’alineament i la temperatura de fusió és:

La temperatura d’alineament ha de ser 5 ºC inferior a la temperatura de fusió (Talineament = Tf encebador – 5 ºC).

Aquesta temperatura serveix de referència, ja que és possible que la temperatura d’alineament determinada amb aquesta regla no sigui l’adequada i s’hagin de fer diversos experiments per determinar la temperatura òptima de la reacció.

La manera més senzilla de calcular la temperatura d’alineament és amb un termociclador de gradient, on en una sola tirada es proven diverses temperatures i així es determina la temperatura òptima d’una reacció concreta. Una Talineament alta evita la unió dels encebadors, i una Talineament baixa afavoreix la unió inespecífica dels encebadors. La conseqüència és que s’obtenen amplificats de mides diverses, que al final del procés s’observen al gel d’agarosa com a bandes inespecífiques.

Seqüències complementàries de l’encebador

Cal evitar les regions amb capacitat de formar estructures secundàries internes, com ara la formació de dímers, la complementarietat entre ells o la formació de forquetes. És indispensable que els encebadors no presentin seqüències amb homologia interna de més de 3 parells de bases. Si l’encebador té zones d’autohomologia, es poden formar estructures en forqueta que interfereixen en l’alineament amb l’ADN motlle. Una homologia parcial a les regions centrals dels encebadors també pot interferir en l’alineament. Si l’homologia es produeix a l’extrem 3’ de qualsevol dels encebadors, es poden formar dímers d’encebadors, que en general impedeixen la formació del producte desitjat per un mecanisme de competència.

Contingut de G/C i trams de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)

El contingut de G:C (Guanina:Citosina) ha d’estar en el rang d’entre el 40 i el 55%. Com més G i C tingui l’encebador, més alta serà la temperatura de fusió (Tf). D’altra banda, també cal evitar les seqüències de poli X (X = G o C o T o A): la presència de seqüències de poli G o poli C afavoreix la hibridació inespecífica. Les seqüències de poli-A i poli-T poden reduir l’eficàcia de l’amplificació, igual que els trams de polipirimidines (T, C) i polipurines (A, G). L’ideal és que els encebadors tinguin una barreja aleatòria de nucleòtids, un contingut de GC del 50 % i una longitud aproximada de 20 bases. D’aquesta manera, la Tf estarà entre 56 i 62 ºC.

Seqüència a l’extrem 3’

Un punt important és incloure un residu de G o C a l’extrem 3’ dels encebadors. Els extrems 3’ amb G/C són adequats perquè els triples enllaços que formen aquestes bases afavoreixen l’eficàcia de la reacció. A més, minimitzen la possibilitat que s’obri la doble cadena formada entre l’encebador i l’ADN que es vol amplificar.

Anàlisi d’encebadors

Un parell d’encebadors que no s’analitzin adequadament poden fer que obtinguis poc producte, productes inespecífics o fins i tot cap producte, a causa d’una amplificació inespecífica i/o de la formació de dímers d’encebadors que competeixen durant la reacció.

Per fer l’anàlisi dels encebadors s’utilitzen eines bioinformàtiques. Amb aquestes eines pots contrastar les seqüències dels encebadors contra bases de dades i així caracteritzar-los. Amb els resultats de l’anàlisi, determines si els encebadors analitzats són adequats o no per fer la reacció de PCR al laboratori.

Dues de les eines més utilitzades són BLAST i Primer-BLAST; no són excloents, sinó que es complementen per a l’anàlisi dels encebadors.

BLAST

Com a exemple, s’analitza un parell d’encebadors per al gen de la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (gadph) d’Ovis aries musimon Mufló comú.

A continuació tens un exemple de seqüència d’encebador sentit i d’encebador antisentit per al gen de gadph d’Ovis aries musiman:

Encebador sentit 5'-CCACTGGGGTCTTCACTACC-3' Encebador antisentit 5'-AAGCAGGGATGATGTTCTGG-3'

Vés a Nucelotide BLAST del NCBI.

Transcriu la seqüència de l’encebador sentit, en sentit 5’ a 3’, marca l’opció «altres» (Others) i utilitza la base de dades de col·lecció de nucleòtids nr/nt (Nucleotide collection nr/nt). Fes clic a l’opció BLAST.

En aquest moment, la seqüència es compara contra la base de dades nr/ nt. Es desplegen els resultats amb les seqüències que BLAST reporta com a similars (o idèntiques) a l’encebador que s’analitza.

A l’exemple es veu clarament que, per a la seqüència analitzada, BLAST ha trobat diverses seqüències similars. Això vol dir que en diverses espècies hi ha una seqüència homòloga a l’encebador sentit; aquesta seqüència pot pertànyer a la mateixa família de proteïnes que s’està analitzant. Per veure l’especificitat de l’espècie d’interès s’analitzen els valors que dóna l’anàlisi.

La tercera secció correspon a les descripcions dels alineaments:

Aquesta és una llista de les seqüències trobades (ordenades segons el seu valor E); cadascun dels alineaments s’avalua per determinar-ne la significació estadística. Els alineaments resultants s’anomenen parells d’alta puntuació High Score Pairs o HSPs, i el valor E o e-valor (e-value) de tall permet definir quin alineament és convenient segons la seva significació estadística: com més petit és el valor d’E, més significatiu és l’alineament. El valor d’E depèn de la base de dades emprada i de la longitud de la seqüència de l’encebador. A més, es desplega una sèrie de dades, com ara l’espècie o espècies amb què coincideix la seqüència de l’encebador sentit i la referència de la seqüència. Busques entre les espècies la que t’interessa i comproves que efectivament sigui el gen d’interès:

TODO. A la nostra cerca no hem trobat l’ovis aries musiman!

És important verificar que la referència del gen analitzat sigui la mateixa que la que es va reportar a l’article de referència de la seqüència. Si la seqüència de l’encebador sentit va ser dissenyada, caldrà verificar que el número de referència de l’encebador sentit reportat a PubMed coincideixi amb el de l’encebador antisentit.

Per analitzar l’encebador antisentit, es pren la seva seqüència, se n’elabora la seqüència complementària i, després, es transcriu la seqüència complementària de dreta a esquerra.

TODO Fer-ho amb biopython.

Encebador sentit 5'-CCACTGGGGTCTTCACTACC-3' Encebador antisentit 5'-AAGCAGGGATGATGTTCTGG-3'

Bibliografia